Spectrophotometre


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Spectrophotomètre

Sommaire

Présentation

Un spectrophotomètre UV-visible (« spectro UV ») est un appareil qui permet de mesurer l'absorbance d'une solution homogène à une longueur d'onde donnée ou sur une région spectrale donnée. Selon la loi de Beer Lambert, l'absorbance d'une solution est proportionnelle à la concentration des substances en solution, à condition de se placer à la longueur d'onde à laquelle la substance absorbe les rayons lumineux. C'est pourquoi la longueur d'onde est réglée en fonction de la substance dont on veut connaître la concentration (doser dans le jargon des chimistes).

  • d'après Beer Lambert, l'absorbance Aλ est fonction de la concentration C de la solution, du coefficient d'absorption molaire  \varepsilon_\lambda et de la longueur de solution à traverser L (en cm ! c'est pour cela que la plupart des cuves sont standardisées à L=1cm).

 A_\lambda = -\log_{10}\frac{I}{I_0} = \varepsilon_\lambda \cdot \ell \cdot C.

 \frac{I}{I_0} est la transmittance de la solution.

  • On remarque que Aλ et  \varepsilon_\lambda sont fonction de la longueur d'onde de travail, elle est choisie en fonction des spectres d'absorbance.
Spectre d'absorbance de NAD+ et de NADH,H+ (wavelength=longueur d'onde)

Ici les deux spectres sont superposés, pour les réaliser indépendamment on a mesuré l'absorbance d'une solution de NAD+ (respectivement de NADH,H+) à différentes longueurs d'ondes (toutes choses égales par ailleurs).

La longueur d'onde d'absorbance maximale est ici λmax=260nm pour les deux molécules, Il sera donc préférable de travailler à cette longueur d'onde. En revanche si on veut doser NADH,H+ lors d'une réaction enzymatique où le NAD+ est réduit en NADH,H+ par exemple, il est plus judicieux de travailler à λ=340nm car ici on ne mesure que NADH,H+ car l'absorbance de NAD+ est nulle même si il est présent dans le mélange.

Cette notion n'est pas applicable aux spectrophotomètres Infrarouge (IR) qui sont essentiellement utilisés pour l’identification. On peut dire que, pratiquement, les spectros UV-visible sont utilisés pour des analyses quantitatives alors que les spectros IR sont des instruments qualitatifs. Tous deux utilisent les principes optiques semblables, mais le spectro IR balaye en fréquence l’échantillon.


Spectrophotomètre de laboratoire (ouvert).
Spectrophotomètre de laboratoire (fermé).
autre spectrophotomètre.

Le spectrophotomètre UV (Ultra Violet) comprend :

La lampe UV est généralement de type deutérium, la lampe visible est généralement de type halogène, il existe également des spectrophotomètres à lampe xénon.

  • un monochromateur formé d'un réseau diffractant la lumière de la source. Il permet de sélectionner la longueur d'onde de la lumière qui traversera la solution à doser.
  • une fente de largeur fixe ou variable pour régler la bande passante.
  • un porte cuve pouvant permettre le maintient à température souhaitée de la solution à analyser, cette température est maintenue par un circuit d'eau ou un effet Peltier. Ce maintient à température fixée est très utile dans les mesures de cinétique enzymatique, en effet, la vitesse de réaction dépend de la température.
  • une cuve transparente dans laquelle on place la solution à étudier. Suivant la qualité et la quantité d'échantillon, il existe différentes cuves, généralement en plastique (spectre visible, UV proche) ou en quartz (UV, mais cuves très chères). Le solvant utilisé n'étant pas toujours transparent, il est obligatoire de réaliser un « blanc » ou témoin de compensation, c'est-à-dire une mise à zéro du dispositif (tarer), en ne plaçant que le solvant utilisé dans la cuve avant la première mesure, et ce pour chaque longueur d'onde étudiée.

Les modèles de recherche sont généralement à double faisceau et utilisent deux cuves, une cuve de référence avec le solvant et la cuve échantillon avec le produit dans le solvant, le solvant est alors soustrait automatiquement (fonction auto-zéro).

  • une cellule photoélectrique, restituant un courant proportionnel au nombre de photons reçus. Sur des modèles récents, le détecteur unique de type photodiode est parfois remplacé par une barrette CCD, ou une barrette de diode (chaque cellule sensible reçoit une couleur fixe). Les modèles les plus sensibles utilisent un détecteur de type photomultiplicateur ou PMT.
  • un détecteur électronique dont la réponse est proportionnelle à ce courant électrique et permet une mesure relative de l'intensité lumineuse.

La spectrophotométrie est utilisée principalement pour connaître la concentration d'une solution colorée (procédé appelé dosage colorimétrique).

Utilisation

Principe

En biologie

  • Le spectrophotomètre est utilisé lors de la réalisation du test MTT.
  • En biologie moléculaire, il est utilisé lors de l'extraction de l'ADN, pour quantifier l'ADN et déterminer sa pureté. On utilise la longueur d'onde 260 nm qui est la zone d'absorbance maximale des acides nucléiques. Une seconde mesure à 280 nm permet de contrôler la pureté de l'extraction, à savoir la présence de protéines résiduelles dans la solution d'ADN. La concentration d'ADN peut-être calculée à partir de la mesure à 260nm en utilisant un facteur de corrélation :
 * ADN double-brin : 1 Abs = 50ng/µl
 * ADN simple-brin :
 * ARN :1 Abs = 40ng/µl

En médecine

L'analyse cinétique de différentes enzymes sanguines, dosage de la phosphatase alcaline : cholestase, lactate déshydrogénase : infarctus du myocarde, hémolyse.

En physique

L'analyse de la lumière permet de vendre les composants chimiques à l'origine de l'émission lumineuse : par exemple la présence de composés chimiques des étoiles.

En chimie

L'analyse de l'absorption des solutions permet le dosage de ces solutions selon une loi d'absorbance (la concentration est proportionnelle au logarithme de l'absorption lumineuse). Il y a donc relation directe entre la quantité de lumière absorbée et la concentration en composé chimique de la solution. Le suivi dans le temps de l'absorption est une méthode de caractérisation de la vitesse de réactions chimiques (cinétique).

Dans les industries graphiques

Il permet de mesurer les couleurs afin de calibrer des périphériques de sorties tels que les traceurs.

Voir aussi

Spectrophotométrie

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