Pyrosequencage

Pyroséquençage

Méthode du pyroséquençage

Le pyroséquençage est une technique qui permet d’effectuer un séquençage rapide et à moindre coût qu’un séquençage par la méthode de Sanger. En effet, cette technique ne nécessite pas de clonage (donc gain de temps et d’argent), et permet une lecture directe de la séquence obtenue après le séquençage.

Ici, les nucléotides ne sont pas ajoutés tous ensemble comme dans une réaction de séquençage normale mais l’un après l’autre. Si le Nucléotide ajouté dans le milieu réactionnel correspond à celui attendu par la Polymérase, il est incorporé dans le brin en cours de synthèse (d’élongation) et libère un Pyrophosphate. Une ATPsulfurylase vient alors transformer ce Pyrophophate (PPi) en ATP qui est alors utilisé, couplé à une Luciférine, par une Luciférase. On a alors production d’Oxyluciférine et d’un signal Lumineux (une Apyrase dégrade les nucléotides en surplus).

C’est le séquenceur ou plus précisément un capteur CCD (Charge-Coupled Device) qui va capter ce signal lumineux et le reproduire sous forme d’un pic sur le Pyrogramme. La hauteur de ce pic est fonction de l’intensité du signal lumineux, elle-même proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés en même temps. On peut donc déduire la séquence à partir de la taille des pics obtenus. Par ailleurs, en cas de mélange de nucléotides à une même position (polymorphisme de séquence), la taille des pics permet d'avoir une quantification de la proportion de brins porteurs de l'un ou l'autre des nucléotides.

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