Marquage des acides nucléiques

Il existe deux principales méthodes de marquage des acides nucléiques. Soit en utilisant des précurseurs radioactifs soit en utilisant des précurseurs fluorescent. Ces précurseurs s'incorporent dans l' ADN et par leurs propriétés il est aisé de les révéler.

Le marquage in vivo

In vivo, on met les cellules en contact avec un précurseur radioactif. Pour marquer spécifiquement l'ADN, on utilise un précurseur avec de la thymidine. La thymidine n'existe pas dans l'ARN. Ce précurseur (Tdr) est phosphoré pour donner de la thymidine monophosphate (TMP). Dans la cellule, la machinerie continue la phosphorylation pour former de la thymidine diphosphate puis triphosphate car c'est ce dernier qui est incorporé dans l'ADN. Pour marquer la thymidine les biologiste utilise le tritium qui prend la place d'un hydrogène. Cette molécule est donc marquée dans l'ADN rendu radioactif.

Pour marquer l'ARN, on utilise l'uridine. L'uridine peut être également marqué au tritium. Pour marquer l'ADN et l'ARN en même temps, il est possible d'utiliser le phosphate radioactif. Il suffit de mettre dans le milieu du ³²PO₄^3-. Il pénètre dans la cellule et est incorporé sur les différents précurseurs. Cette méthode a pour avantage de ne marquer que les acide nucléiques en cours de synthèse.

In vitro

In vitro, il est possible de marquer l'ADN dans sa masse. C’est-à-dire que l'on peut insérer des atomes radioactifs soit dans sa longueur (marquage interne), soit aux extrémités. On peut également utiliser des marqueurs fluorescents.

Marquage interne

Marquage par translation de coupure (nick translation)

On utilise pour cela:

1. l'endonucléase DNase I qui provoque des coupures simple brin au hasard sur l'ADN.
2. le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I (= enzyme) isolée d'Escherichia coli. Il est capable en utilisant comme modèle le brin complémentaire, d'ajouter des nucléotides à une extrémité 3'-OH lorsqu'un brin d'une molécule d'ADN est coupé (activité polymérase 5'→3'). Cette enzyme a aussi une activité 3'→5' exonucléasique (qui élimine des nucléotides en allant vers le côté 5'-P de la coupure).
3. Des nucléotides marqués au 32P à haute radioactivité spécifique.

On obtient au final de l'ADN bicaténaire dont certaines régions sont fortement marquées.

Notes et références

• Principes des techniques de biologie moléculaire 2^e édition D. TAGU, C. MOUSSARD, éds INRA éditions